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ग्राम दाग कैसे करें

ग्राम स्टेन जैसे ऊतक के नमूने में बैक्टीरिया चिह्नित करने के लिए और जीवाणुओं की उपस्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल एक तेजी से प्रक्रिया है ग्राम पॉजिटिव या ग्राम नकारात्मक सेल दीवारों की रासायनिक और भौतिक गुणों के आधार पर। यह रंग लगभग हमेशा एक जीवाणु संक्रमण के निदान में पहला कदम के रूप में किया जाना चाहिए।

प्रक्रिया डेनिश वैज्ञानिक हैंस क्रिश्चियन ग्राम (1853 - 1938) के बाद नामित किया गया था, जो 1882 में तकनीक विकसित की और 1884 में प्रकाशित एक प्रक्रिया के रूप में समान नैदानिक ​​लक्षणों के साथ बैक्टीरिया के दो प्रकार के बीच अंतर करना: स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया (जिसे न्यूमोकोकस भी कहा जाता है) और क्लेबसीला निमोनिया.

चरणों

भाग 1
ब्लेड की तैयारी

चित्र शीर्षक ग्राम दाग चरण 1
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प्रयोगशाला में काम के लिए तैयार हो जाओ दस्ताने रखो और लंबे बालों को बाँध लें, ताकि परीक्षण के नमूने को दूषित न करें। रासायनिक हुड या अन्य अच्छी तरह हवादार क्षेत्र के नीचे एक काम की जगह कीटाणुरहित करें और देखें कि क्या बन्सन नोजल और माइक्रोस्कोप शुरू करने से पहले काम कर रहे हैं
  • ग्राम स्टाईन चरण 2 नामक छवि
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    एक माइक्रोस्कोप के लिए एक गिलास स्लाइड को जीवाणुरहित करें यदि ब्लेड गंदे है, तो इसे तेल और मिट्टी को हटाने के लिए साबुन और पानी से धो लें। इसे इथेनॉल, एक गिलास क्लीनर या आपकी प्रयोगशाला द्वारा अनुशंसित पद्धति का उपयोग करके कीटनाशक करना।
  • ग्राम स्टैन चरण 3 नामक छवि
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    नमूना को स्लाइड पर रखें। आप मेडिकल नमूने या पेट्री डिश पर उगने वाले जीवाणु संस्कृतियों में मौजूद बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए ग्राम स्टेनेस विधि का उपयोग कर सकते हैं। उपयोगी होने की विधि के लिए, एक परत डालें पतला धुंधला में नमूना का यह 24 घंटे से कम उम्र के नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की जाती है, क्योंकि पुराने जीवाणुओं ने कोशिका की दीवारों को क्षति पहुंचाई है जो प्रक्रिया को कम अनुमान लगाएगा।
    • यदि आप ऊतक के नमूने का उपयोग कर रहे हैं, तो स्लाइड पर एक या दो बूंदों को रखें और समान रूप से फैलाकर दूसरे पतली स्थान की कांच की तरफ का उपयोग करके एक पतली जगह बना सकते हैं। जारी रखने से पहले सूखी हवा की अनुमति दें
    • यदि आप पेट्री डिश से बैक्टीरिया का उपयोग कर रहे हैं, तो बन्सन टॉउट में एक इनोक्यूलेटिंग पाश को बाध्य कर दें जब तक कि वह चमकता नहीं और फिर शांत हो। ब्लेड पर आसुत जल की एक बूंद डाल करने के लिए और उसके बाद नसबंदी और बैक्टीरिया के एक छोटा सा नमूना स्थानांतरित करने से पहले फिर से संभाल सूखी और इसे धीरे मिश्रण पानी में प्रयोग करें।
    • शोरबा में बैक्टीरिया को एक आंदोलक में मिश्रित किया जाना चाहिए और फिर ऊपर के रूप में अधिक पानी के अतिरिक्त बिना एक inoculating पाश के साथ जोड़ा जाना चाहिए।
    • यदि आपके पास एक स्बैब नमूना है, तो ब्लेड के माध्यम से धीरे से फ्लैब को रोल करें।
  • चित्र शीर्षक ग्राम दाग चरण 4
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    गर्मी का उपयोग दाग को ठीक करें गर्मी जीवाणुओं को स्लाइड पर सेट कर देगा ताकि धुंधला होने के दौरान उन्हें आसानी से धुलाई नहीं किया जा सके। बेंसेन बर्नर की लौ के माध्यम से ब्लेड दो या तीन बार जल्दी से पास करें या इलेक्ट्रिक ब्लेड हीटर पर गर्मी करें। इसे ज़्यादा मत करो, या आप नमूने विकृत कर सकते हैं। यदि एक बन्सन नोजल का उपयोग करते हुए, लौ एक छोटी, नीली शंको, एक लंबा, नारंगी लौ नहीं होनी चाहिए।
    • वैकल्पिक रूप से, सूखा स्थान में मेथनॉल की एक या दो बूंदों को जोड़कर दाग को तय किया जा सकता है, अतिरिक्त उत्पाद को निकाल कर और सूखी हवा को हवा दे सकते हैं। इस पद्धति से मेजबान कोशिकाओं को नुकसान कम करता है, जिससे एक क्लीनर पृष्ठभूमि होती है।
  • चित्र का शीर्षक ग्राम दाग़ चरण 5
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    एक रंग ट्रे में ब्लेड की स्थिति। इसमें धातु, कांच या प्लास्टिक की एक छोटी स्क्रीन धारक या शीर्ष पर तार के साथ एक उथले प्लेट होती है। इस धारक पर ब्लेड रखें ताकि आप उपयोग कर रहे तरल पदार्थ ट्रे में पलायन कर सकें।
    • यदि आपके पास धुंधला ट्रे नहीं है, तो ब्लेड को प्लास्टिक के बर्फ के रूप में सीधे रखा जा सकता है।
  • भाग 2
    ग्राम दाग करना

    ग्राम स्टाईन चरण 6 के शीर्षक वाला चित्र
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    जेंडर वायलेट के साथ दाग सोखें जेनेटियस वायलेट के कई बूंदों, कभी-कभी क्रिस्टल वायलेट या मिथाइल वायलेट के नाम से बैक्टीरिया के नमूने को सोखने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें। 30 से 60 सेकंड तक प्रतीक्षा करें। गेंटियन बैंगनी जलीय समाधानों में पृथक होता है, सीवी + और सीएल (सीएल-) बनाता है। ये आयन ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक कोशिकाओं की दीवार और झिल्ली को घुसना करते हैं। सीवी + आयन बैंगनी कोशिकाओं के नकारात्मक चार्ज घटकों के साथ संपर्क करता है ताकि वे बैंगनी रंग में डाई जाए।
    • वर्षा को रोकने के लिए कई प्रयोगशालाएं अमोनियम ऑक्सलेट के साथ जेनेरियन वायलेट का उपयोग करती हैं।
  • चित्र शीर्षक ग्राम स्टैन चरण 7
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    धीरे से जेनेरियन वायलेट को कुल्ला। ब्लेड झुकाएं और ब्लेड पर कुछ नल या आसुत जल फेंकने के लिए एक धार का प्रयोग करें। पानी को दाग की सतह से गुजरना चाहिए, लेकिन सीधे इसे ऊपर नहीं फेंक दिया जाना चाहिए। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के धुंधला को दूर करने के लिए बहुत ज्यादा कुल्ला नहीं करें
  • चित्र शीर्षक ग्राम दाग चरण 8
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    आयोडीन के साथ दाग भरी और कुल्ला। आयोडीन के साथ स्थान को कवर करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें और इसे कम से कम 60 सेकंड के लिए कार्य करें। फिर एक ही विधि से ध्यान से कुल्ला। नकारात्मक आयनों का आरोप लगाया के रूप में आयोडीन, सेल के भीतरी और बाहरी परतों के भीतर किरात वायलेट और आयोडीन (CV-मैं परिसरों) की बड़ी परिसरों के लिए फार्म, बैंगनी पकड़े जहाँ भी यह है के साथ कुलपति + सूचना का आदान प्रदान।
    • आयोडिन संक्षारक है साँस लेना, घूस या त्वचा के साथ संपर्क से बचें।
  • चित्र का शीर्षक ग्राम स्टैन चरण 9
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    एक ब्लीच जोड़ें और जल्दी से कुल्ला एसीटोन और इथेनॉल का 1 से 1 मिश्रण आम तौर पर इस महत्वपूर्ण चरण के लिए उपयोग किया जाता है, जिसे सावधानीपूर्वक समयानुसार होना चाहिए इच्छुक ब्लेड को पकड़ो और ब्लीच जोड़ें जब तक वायलेट बाहर निकलने वाले तरल में दिखाई नहीं देता। यदि आमतौर पर एसीटोन की उच्च सांद्रता होती है तो इस प्रक्रिया में आमतौर पर 10 सेकंड या उससे कम समय लगता है। तुरंत बंद करो या ब्लीच सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं से जेनेरियन वायलेट का दाग हटा देगा, जिसके कारण परीक्षण दोहराया जाएगा। पूर्व कला का तुरंत इस्तेमाल करते हुए कुल्ला
    • मिश्रण के स्थान पर शुद्ध एसीटोन (> 95%) का उपयोग किया जा सकता है अधिक एसीटोन, ब्लीच तेजी से काम करेगा, समय की अधिक सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है।
    • यदि आपको इस चरण के लिए समय निर्धारित करने में परेशानी हो रही है, तो ड्रॉप द्वारा ब्लीच ड्रॉप को जोड़ने पर विचार करें।
  • चित्र शीर्षक ग्राम दाग़ चरण 10
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    दाग को एक विपरीत रंग के साथ भिगोएँ और कुल्ला। इसके विपरीत डाई, आमतौर पर सैफरैनीन या fuchsin, एक अतिरिक्त गुलाबी या लाल की फीका पड़ा हुआ ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक रंगाई के बीच विपरीत (ग्राम नकारात्मक) जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है। कम से कम 45 मिनट के लिए छोड़ दें और कुल्ला।
    • फ्यूशिन कई ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को दाग देगा, जैसे कि हीमोफिलस एसपीपी और लेनिओनेला एसपीपी, इसलिए शुरुआती के लिए यह एक बेहतर विकल्प है।
  • चित्र का शीर्षक ग्राम स्टैन चरण 11
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    ब्लेड सूखी आप इसे हवा में सूख सकते हैं या उस उद्देश्य के लिए बेचे गए ब्लोटिंग पेपर का उपयोग कर उसे टैप कर सकते हैं। ग्राम धुंधला समाप्त
  • भाग 3
    परिणाम की जांच

    चित्र का शीर्षक ग्राम दाग़ चरण 12
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    ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप तैयार करें सूक्ष्मदर्शी के नीचे ब्लेड रखें। जीवाणु आकार में बहुत भिन्न हो सकते हैं, इसलिए आवश्यक कुल आवर्धन 400x से 1000x तक हो सकता है। उच्च आवर्धन मूल्यों पर, स्पष्टता के लिए तेल में डूबे जाने वाले उद्देश्य लेंस का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। फफोले को रोकने के लिए आवेदन के दौरान बहुत अधिक आंदोलनों बनाने से बचने, ब्लेड पर तेल की सूई ड्रॉप करें। माइक्रोस्कोप से रिवॉल्वर को ले जाएं ताकि ऑयल लेंस को तेल को छूकर लॉक लगाया जा सके।
    • तेल में विसर्जन केवल विशेष लेंस पर इस्तेमाल किया जा सकता है, "सूखी" लेंस नहीं।
  • ग्राम स्टाईन चरण 13 के शीर्षक वाला चित्र
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    ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को पहचानें सूक्ष्मदर्शी-ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के नीचे स्लाइड की जांच करें इसकी मोटी सेल की दीवारों में फंसे गेरियन वायलेट के कारण बैंगनी हो जाएगा। ग्राम-नकारात्मक लाल या गुलाबी होगा क्योंकि वायलेट पतली सेल की दीवारों के माध्यम से धोया जाता है और फिर गुलाबी इसके विपरीत रंग उनके माध्यम से प्रवेश किया है।
    • यदि नमूना बहुत मोटी है, तो आप झूठी सकारात्मक देख सकते हैं। यदि सभी प्रकार के बैक्टीरिया ग्राम-पॉजिटिव होते हैं, तो परिणाम की पुष्टि करने के लिए एक और नमूने के साथ परीक्षण को दोहराएं।
    • अगर डिकोलाइज़र बहुत लंबा कार्य कर रहा है, तो आप गलत नकारात्मक देख सकते हैं। यदि सभी प्रकार के जीवाणु ग्राम-नकारात्मक होते हैं, तो परिणाम की पुष्टि करने के लिए परीक्षण को दोबारा दोहराएं।
  • चित्र शीर्षक ग्राम दाग चरण 14
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    संदर्भ चित्रों के लिए देखो। यदि आप एक जीवाणु की उपस्थिति के बारे में सुनिश्चित नहीं हैं, तो प्रारूप द्वारा आयोजित संदर्भ छवियों का एक संग्रह देखें और ग्राम धुंधला होने के परिणाम देखें। आप ऑन-लाइन डेटाबेस को ऑनलाइन ढूंढ सकते हैं अमेरिकन डाटाबेस ऑफ़ माइक्रोबियल पैथोजेन्स, पर तस्वीरें में बैक्टीरिया और कई अन्य साइटें पहचान को आसान बनाने के लिए, हम स्थिति और प्रारूप द्वारा निदान के लिए सामान्य या महत्वपूर्ण उदाहरणों की सूची नीचे सूचीबद्ध करते हैं।
  • ग्राम स्टैन चरण 15 शीर्षक वाला चित्र
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    प्रारूप द्वारा ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया को पहचानें बैक्टीरिया को उनके प्रारूप द्वारा माइक्रोस्कोप के तहत वर्गीकृत किया जाता है, अधिक सामान्यतः कोसी (गोलाकार) या बेसीली (बेलनाकार) के रूप में। प्रारूप द्वारा आयोजित कुछ सामान्य ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया यहां हैं:
    • ग्राम पॉजिटिव कॉकी वे आमतौर पर हैं staphylococci (गुच्छे में कोकून) या स्ट्रेप्टोकोक्की (चेन नारियल)।
    • ग्राम पॉजिटिव बासीली इनमें शामिल हैं रोग-कीट, क्लोस्ट्रीडियम, Corynebacterium और लिस्टेरिया. बासीली Actinomyces एसपीपी अक्सर शाखाओं या तंतुओं होते हैं।
  • चित्र शीर्षक ग्राम स्टैन चरण 16
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    ग्राम-नकारात्मक जीवाणुओं को पहचानें ग्राम-नकारात्मक (गुलाबी) को अक्सर तीन समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: कोसी, गोलाकार होते हैं, बासीली लंबी और पतली होती हैं, और कोकोइड बासीली बीच में होती हैं।
    • ग्राम-नकारात्मक कोसी सबसे आम हैं नेइसेरिया एसपीपी।
    • ग्राम-नकारात्मक बासीली इनमें शामिल हैं ई। कोलाई, Enterobacter, क्लेबसिएला, Citrobacter, सेराटिया, रूप बदलनेवाला प्राणी, साल्मोनेला, शिगेला, स्यूडोमोनास और कई अन्य बैक्टीरिया विब्रियो कोलेरे आम या घुमावदार बासीली के समान हो सकता है
    • ग्राम-नकारात्मक कोकोकिद बासीली (या "कोकोब्सीली") इनमें शामिल हैं Bordetella, ब्रूसिला, हेमोफिलस और पास्चरेला.
  • चित्र का शीर्षक ग्राम स्टैन चरण 17
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    मिश्रित परिणाम का मूल्यांकन करें कुछ बैक्टीरिया को रंगीन दीवारों की कमजोरी या मोमी रूप के कारण ठीक से रंगना मुश्किल होता है उनके पास एक ही सेल में बैंगनी या गुलाबी धुंधला हो सकता है, या एक ही नमूना के विभिन्न कोशिकाओं के बीच हो सकता है। 24 घंटे से अधिक के साथ बैक्टीरिया का कोई भी नमूना यह समस्या हो सकती है, लेकिन कुछ प्रजातियों किसी भी उम्र में रंग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं और अधिक विशिष्ट परीक्षण की आवश्यकता ऐसे ज़ेहल-नील्सन के रूप में, पहचान को कम करने, संस्कृति के विकास को देख, टीएसआई अगर या जेनेटिक टेस्ट
    • एक्टिनोमाइसेस, Arthobacter, Corynebacterium, माइकोबैक्टीरियम और प्रोपियोनीबेक्टेरियम एसपीपी सभी को ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया माना जाता है, लेकिन अक्सर इस परीक्षण में निर्णायक परिणाम नहीं मिल सकते हैं।
    • छोटे और ठीक बैक्टीरिया जैसे जैसे Treponema, क्लैमाइडिया और रिकेटसिआ एसपीपी। इस तकनीक का उपयोग करके ठीक से रंगना मुश्किल है
  • ग्राम स्टैन चरण 18 नामक चित्र
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    सामग्री से छुटकारा पाएं उपयोग की जाने वाली प्रयोगशाला और सामग्री के आधार पर अपशिष्ट निपटान प्रक्रिया अलग-अलग होती है। आम तौर पर, धुंधला ट्रे से तरल को खतरनाक कचरे के रूप में मुहरबंद बोतल में छोड़ दिया जाता है। स्लाइड्स को 10% ब्लीच समाधान में डुबो दें और फिर उन्हें तेज सामग्री के निपटान के लिए कंटेनर में त्याग दें।
  • युक्तियाँ

    • याद रखें कि ग्राम धुंधला का नतीजा नमूना के रूप में अच्छा है। उदाहरण के लिए, स्पटम नमूनों में थूक और गहरी कफ के बीच अंतर दिखाने के लिए मरीजों को अच्छा नमूने देने के लिए यह महत्वपूर्ण है।
    • एक ब्लीच के रूप में, इथेनॉल एसीटोन से धीरे धीरे अधिक काम करता है।
    • मानक प्रयोगशाला सावधानी बरतें
    • अभ्यास के लिए एक गाल स्वब नमूना का प्रयोग करें क्योंकि इसमें ग्राम पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया होना चाहिए। यदि आप केवल एक प्रकार या दूसरे को देखते हैं, तो आप शायद बहुत ब्लीच या बहुत कम उपयोग कर रहे हैं
    • ब्लेड लेने के लिए आप एक स्प्रिंग लोडेड लकड़ी के कपड़े प्रचारक का उपयोग कर सकते हैं।

    चेतावनी

    • एसीटोन और इथेनॉल ज्वलनशील होते हैं और पहला हाथ आपके हाथों से तेल निकाल देगा, जिससे त्वचा अन्य रसायनों को अधिक आसानी से अवशोषित करेगी। तो दस्ताने पहनें और सावधान रहें
    • इससे पहले कि आप दाग या काउंटर दाग कुल्ला पहले नमूना सूखी मत देना।

    आवश्यक सामग्री

    • नमूना कपड़ा
    • ग्लास ब्लेड
    • विंदुक
    • एक लौ स्रोत, एक ब्लेड हीटर या मेथनॉल
    • पानी
    • Gentian वायलेट
    • आयोडीन
    • शराब या एसीटोन जैसे डिलोराइज़िंग एजेंट
    • सैफरैनीन

    सूत्रों और कोटेशन

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